Un peptide è una catena di amminoacidi uniti da legami peptidici e produrne uno significa costruire quella catena in un ordine preciso. La maggior parte dei peptidi viene prodotta tramite la sintesi peptidica in fase solida, in cui amminoacidi protetti vengono aggiunti uno alla volta a una catena in crescita ancorata su una resina, e la catena finita viene poi tagliata e purificata. Questa guida spiega come funziona la sintesi dei peptidi, i metodi principali e dove ciascuno di essi viene utilizzato, e in che modo un fornitore decide quale percorso si adatta a una determinata sequenza.
L'idea di base: un amminoacido alla volta
La sintesi chimica dei peptidi procede dall'estremità C-terminale all'estremità N-terminale, aggiungendo un singolo amminoacido in ogni ciclo. Ogni amminoacido è dotato di gruppi protettivi in modo che si formi solo il legame previsto. Un reagente di accoppiamento (coupling) attiva il gruppo carbossilico dell'amminoacido in ingresso in modo che si unisca all'ammina libera della catena, quindi quella nuova ammina viene deprotetta affinché il residuo successivo possa attaccarsi. La ripetizione di questo ciclo costruisce la sequenza. Se l'ordine, la protezione e l'accoppiamento sono corretti, si ottiene il peptide bersaglio; se un accoppiamento risulta incompleto, si ottengono sequenze di delezione.
Sintesi peptidica in fase solida (SPPS)
La SPPS è il metodo alla base della maggior parte dei peptidi prodotti oggi. La catena è ancorata tramite la sua estremità C-terminale a una resina insolubile e i reagenti vengono aggiunti alla sospensione circostante. Poiché la catena è attaccata alla resina, i reagenti in eccesso e i sottoprodotti vengono semplicemente lavati via tra un passaggio e l'altro; ciò consente ai chimici di portare a termine ogni accoppiamento con un ampio eccesso di reagente e saltare le purificazioni intermedie che rallenterebbero la chimica in soluzione. Un singolo ciclo si presenta in questo modo:
- Rimuovere il gruppo protettivo dall'ammina N-terminale della catena sulla resina.
- Lavare via i reagenti di deprotezione.
- Accoppiare l'amminoacido protetto successivo, attivato da un reagente di accoppiamento.
- Lavare via il reagente in eccesso e i sottoprodotti.
- Bloccare (capping) eventuali catene non reagite affinché non diventino sequenze di delezione.
- Ripetere finché la sequenza non è completa, quindi scindere (clivaggio) il peptide dalla resina e rimuovere la protezione della catena laterale.
Esistono due strategie di protezione. L'approccio originale Boc utilizza acido per rimuovere il gruppo temporaneo e acido forte come l'HF per il clivaggio finale. La più recente strategia Fmoc l'ha ampiamente sostituita: il gruppo Fmoc viene rimosso in ambiente basico blando, solitamente piperidina in DMF, e le catene laterali e il legame alla resina vengono scissi con acido trifluoroacetico. La chimica Fmoc è più blanda, più pulita e facile da automatizzare, motivo per cui domina la ricerca e gran parte della produzione di peptidi farmaceutici. La strategia Boc trova ancora spazio per alcune sequenze sensibili o inclini all'aggregazione.
Sequenze difficili
Non tutte le sequenze si assemblano senza problemi. Peptidi lunghi e tratti di residui idrofobici tendono a ripiegarsi o ad aggregarsi sulla resina, nascondendo l'estremità reattiva e bloccando l'accoppiamento. I chimici hanno una serie di strumenti per risolvere questo problema: dipeptidi pseudoprolinici che scompongono le regioni problematiche, accoppiamenti doppi o estesi, riscaldamento a microonde che accelera ogni passaggio e migliora la resa, e protezione dello scheletro peptidico (backbone). Individuare questi punti critici prima della sintesi è gran parte del valore aggiunto portato da un chimico peptidico esperto, perché è molto più economico progettare una strategia attorno a una sequenza difficile piuttosto che doverla ri-sintetizzare.
Sintesi peptidica in fase liquida (LPPS)
La LPPS costruisce il peptide in soluzione, senza alcuna resina. Richiede maggiore pianificazione, poiché non esiste un unico protocollo che funzioni per ogni sequenza e i gruppi protettivi, i reagenti e i solventi devono essere scelti caso per caso. In compenso, utilizza meno reagenti ed è più facile da ottimizzare su grandi volumi, il che la rende conveniente per peptidi corti e per la produzione su scala chilogrammo e commerciale. Metodi in soluzione più recenti che taggano (etichettano) la catena in crescita per semplificarne la gestione stanno riducendo il divario tra la scala di laboratorio e quella industriale.
Percorsi ibridi e condensazione di frammenti
Per peptidi lunghi o complessi, i due approcci vengono combinati. I frammenti protetti vengono costruiti tramite SPPS, scissi e purificati, quindi uniti in soluzione mediante condensazione di frammenti per assemblare l'intera sequenza. Questo percorso convergente evita il calo delle rese che si verifica con una SPPS lineare molto lunga ed è un modo comune per raggiungere target grandi e difficili su larga scala.
Espressione ricombinante
La chimica non è l'unica opzione. Peptidi molto lunghi e piccole proteine, specialmente sequenze naturali richieste in grandi quantità, vengono spesso prodotti facendoli crescere in cellule ingegnerizzate come l'E. coli. Ciò richiede più lavoro di preparazione ma può essere più economico per lunghe sequenze in alti volumi. In pratica, il confine tra produzione chimica e biologica si aggira intorno ai cento residui e la scelta dipende dalla sequenza, dalle modifiche e dalla quantità.
Purificazione e controllo qualità
La sintesi è solo metà del lavoro. Dopo che il peptide è stato scisso dalla resina, viene purificato, solitamente tramite HPLC preparativa a fase inversa, per rimuovere le sequenze di delezione e altre sostanze correlate usate come standard di riferimento. Il peptide purificato viene poi controllato mediante HPLC analitica per verificarne la purezza e tramite spettrometria di massa per confermarne l'identità, quindi liofilizzato e rilasciato con un certificato di analisi. Per i lavori che coinvolgono cellule o animali, l'acido trifluoroacetico residuo della sintesi viene solitamente scambiato con un sale acetato o cloridrato.
Quale metodo si adatta a quale peptide
Il percorso viene scelto in base alla sequenza, alla scala e alle modifiche, non per abitudine.
| Metodo | Come funziona | Ideale per |
| Fase solida (SPPS) | La catena viene costruita su una resina, un residuo alla volta, per poi essere scissa | La maggior parte dei peptidi di ricerca e molti peptidi farmacologici; veloce e automatizzato |
| Fase liquida (LPPS) | La catena viene costruita in soluzione, senza resina | Peptidi corti e produzione su larga scala o commerciale |
| Ibrido / condensazione di frammenti | I frammenti vengono prodotti tramite SPPS e poi uniti insieme in soluzione | Peptidi lunghi o complessi prodotti su scala |
| Espressione ricombinante | Il peptide viene fatto crescere in cellule ingegnerizzate come E. coli | Peptidi molto lunghi in grandi quantità |
Qual è il metodo di sintesi peptidica giusto per un progetto?
Per la maggior parte dei peptidi di ricerca e molti peptidi farmacologici fino a una lunghezza moderata, la sintesi in fase solida con chimica Fmoc è l'opzione predefinita, perché è veloce, automatizzata e affidabile. Peptidi corti e lotti commerciali di grandi dimensioni si spostano spesso verso percorsi in fase liquida o ibridi per questioni di costo. Le sequenze lunghe e complesse vengono costruite mediante condensazione dei frammenti e le sequenze naturali molto lunghe su grandi volumi possono essere prodotte in modo ricombinante. La risposta più pratica è fornire a un fornitore di peptidi la sequenza, la purezza, la quantità e le eventuali modifiche, lasciando a loro il compito di abbinare il metodo — e valutare cosa determina il prezzo finale prima di impegnarsi in un percorso.
Come SynPeptide produce i peptidi
SynPeptide (Nanjing SynPeptide Biological Technology) produce peptidi dal 2013 e gestisce internamente i principali percorsi di sintesi. La sintesi copre un intervallo da 2 a 200 amminoacidi utilizzando metodi in fase solida, assistiti da microonde e di condensazione dei frammenti, in modo che sia i brevi principi attivi sia le lunghe sequenze difficili rientrino nell'ambito di competenza. Le sequenze personalizzate passano attraverso la sintesi di peptidi su misura, le modifiche strutturali attraverso la modifica dei peptidi e gli ordini all'ingrosso attraverso la sintesi di peptidi su larga scala, con sequenze in stock disponibili come peptidi a catalogo. Ogni lotto è caratterizzato mediante HPLC e spettrometria di massa e rilasciato con un certificato di analisi.
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FAQ
Come vengono prodotti i peptidi?
La maggior parte dei peptidi viene prodotta tramite sintesi chimica, aggiungendo un amminoacido protetto alla volta a una catena in crescita, il più delle volte su un supporto di resina solida. La catena viene poi scissa dalla resina, purificata tramite HPLC e controllata mediante spettrometria di massa. I peptidi molto lunghi possono invece essere prodotti biologicamente in cellule ingegnerizzate.
Cos'è la sintesi peptidica in fase solida (SPPS)?
La sintesi peptidica in fase solida, o SPPS, costruisce un peptide su una resina insolubile. L'estremità C-terminale è ancorata alla resina e gli amminoacidi vengono aggiunti uno per uno attraverso passaggi ripetuti di accoppiamento e deprotezione, con i reagenti in eccesso lavati via a ogni ciclo. È il modo più comune per produrre peptidi perché è veloce e facile da automatizzare.
Qual è la differenza tra la chimica Fmoc e Boc?
Entrambe sono strategie di utilizzo di gruppi protettivi per la SPPS. Il metodo Fmoc utilizza una base blanda, solitamente piperidina, per rimuovere il gruppo temporaneo e TFA per il clivaggio finale, ed è il metodo moderno standard. Il metodo Boc usa acido per la deprotezione e un acido forte come l'HF per il clivaggio; è più vecchio e più aggressivo ma ancora utile per alcune sequenze difficili.
Qual è la differenza tra SPPS e LPPS?
La SPPS costruisce il peptide su una resina solida, il che lo rende veloce e facile da automatizzare, ed è l'ideale per la ricerca su scala moderata. La LPPS costruisce il peptide in soluzione senza resina, il che richiede più pianificazione ma utilizza meno reagenti ed è conveniente per peptidi corti e produzione su larga scala. I peptidi lunghi sono spesso realizzati con un ibrido dei due metodi.
Quanto può essere lungo un peptide sintetico?
La sintesi in fase solida di routine gestisce bene peptidi fino a circa cinquanta residui, e i laboratori più esperti si spingono oltre, nel range tra cento e duecento residui, utilizzando metodi ibridi e di condensazione dei frammenti. Oltre ai cento residui circa, l'espressione biologica è spesso la scelta più economica per grandi quantità.
Come vengono purificati i peptidi dopo la sintesi?
Il peptide grezzo viene purificato tramite HPLC preparativa a fase inversa, che separa il target desiderato dalle sequenze di delezione e da altre impurezze. Il materiale purificato viene confermato mediante HPLC analitica e spettrometria di massa, liofilizzato e rilasciato con un certificato di analisi, con uno scambio salino se l'applicazione lo richiede.
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Synpeptide
Azienda CRO/CDMO specializzata in peptidi
Il team di ricerca di SynPeptide riunisce ricercatori specializzati nella sintesi, purificazione e analisi valutativa dei peptidi. Basandosi sulle competenze maturate sul campo con la sintesi conto terzi e la gamma standard di peptidi, pubblichiamo informazioni basate su evidenze rivolte a ricercatori, responsabili dello sviluppo di formulazioni e sviluppatori di prodotti. Tutti i contenuti pubblicati sono verificati sulla base delle più recenti pubblicazioni scientifiche e dei dati interni di controllo qualità. Poniamo grande attenzione all'accuratezza e alla riproducibilità, incarnando la filosofia di SynPeptide di diffondere informazioni corrette sulla scienza dei peptidi.
