Come funziona la Sintesi di Peptidi su Misura
La sintesi di peptidi su misura consiste nella costruzione di una catena peptidica un amminoacido alla volta, seguendo l'esatta sequenza fornita da un cliente. I due principali percorsi industriali sono la sintesi peptidica in fase solida (SPPS) e la sintesi peptidica in fase liquida (LPPS). Al giorno d'oggi, la maggior parte degli ordini personalizzati viene eseguita su SPPS perché è veloce, scrivibile su sintetizzatori automatizzati e facile da purificare tra un passaggio e l'altro.
Il Ciclo SPPS, Passo dopo Passo
Nella SPPS il primo amminoacido è ancorato a una perla di resina insolubile e la catena cresce dal C-terminale verso l'N-terminale attraverso cicli ripetuti di deprotezione e accoppiamento.
- Caricamento della resina — l'amminoacido C-terminale è attaccato a un supporto di resina solida; la scelta della resina dipende dalla necessità di un acido C-terminale o di un'ammide.
- Deprotezione — il gruppo protettivo temporaneo (solitamente Fmoc) sul gruppo alfa-amminico viene rimosso con una base, esponendo un'ammina libera per l'accoppiamento successivo.
- Accoppiamento — l'amminoacido protetto successivo viene attivato e unito alla catena legata alla resina, formando un nuovo legame peptidico. L'eccesso di reagente spinge l'accoppiamento quasi fino al completamento.
- Lavaggio — la resina viene risciacquata con solvente per eliminare i reagenti in eccesso e i sottoprodotti. La sola filtrazione pulisce la catena a ogni ciclo, il che costituisce il vantaggio principale della SPPS.
- Ripetizione — le fasi di deprotezione, accoppiamento e lavaggio vengono ripetute per ogni residuo fino all'assemblaggio dell'intera sequenza.
- Scissione e deprotezione globale — il peptide finito viene tagliato dalla resina e tutti i gruppi protettivi della catena laterale si staccano, di solito con un cocktail di TFA.
- Purificazione e QC — il peptide grezzo viene purificato tramite HPLC a fase inversa e confermato per identità e purezza mediante spettrometria di massa.
Chimica Fmoc vs Boc
La SPPS utilizza una delle due strategie di gruppo protettivo: Fmoc/tBu o Boc/Bzl. La chimica Fmoc è lo standard attuale per la maggior parte dei lavori su misura perché viene eseguita in condizioni più blande: il gruppo Fmoc si stacca con una base come la piperidina, e la scissione finale utilizza TFA invece del pericoloso HF (acido fluoridrico) richiesto dal sistema Boc/Bzl. Usiamo la SPPS basata su Fmoc come impostazione predefinita per la maggior parte degli ordini personalizzati e passiamo a LPPS o a percorsi ibridi quando la sequenza lo richiede.
Cosa rende una sequenza difficile da costruire
Alcune caratteristiche preannunciano problemi prima ancora che inizi la sintesi. I lunghi tratti idrofobici fanno sì che la catena in crescita si ripieghi e si agglomeri sulla resina, il che blocca l'accoppiamento. Le sequenze oltre circa 50 residui perdono resa man mano che si sommano le piccole perdite per ogni passaggio. Le cisteine multiple necessitano di una formazione dei ponti disolfuro controllata e regioselettiva, in modo che i ponti corretti si accoppino. Motivi come Asp-Gly sono inclini a reazioni collaterali all'aspartimmide. Esaminiamo questi modelli in anticipo e adattiamo il percorso, i reagenti di accoppiamento o lo schema dei gruppi protettivi per mantenere alta la purezza.
Scegliere la Giusta Purezza
Abbina il grado all'esperimento. I peptidi grezzi e con purezza superiore al 75% si adattano allo screening iniziale, ai test ELISA e all'immunizzazione. Una purezza compresa tra oltre il 90% e il 95% copre la maggior parte dei saggi quantitativi e dei lavori struttura-funzione. Oltre il 95% al 98% è la scelta giusta per test cellulari, studi in vivo, SAR e qualsiasi sviluppo farmaceutico, in cui una sequenza di delezione estranea potrebbe alterare il risultato. Quando non sei sicuro, inviaci l'applicazione insieme alla sequenza e ti consiglieremo il grado adeguato.
Tutti i peptidi sono forniti esclusivamente per la ricerca, l'analisi e lo sviluppo farmaceutico.
