Il controllo delle impurezze è una delle parti più complesse nella produzione di un farmaco peptidico, per un semplice motivo: le impurezze assomigliano quasi al peptide stesso. Un singolo residuo mancante, uno stereocentro invertito o un legame disolfuro rimescolato producono una molecola che si posiziona proprio accanto al picco principale e si comporta in modo molto simile ad esso. Tenerle sotto controllo richiede metodi analitici specifici per i peptidi e standard di riferimento ben caratterizzati. Questa guida copre i principali tipi di impurezze peptidiche, come vengono controllate, cosa si aspettano le autorità di regolamentazione e qual è il ruolo degli standard di riferimento, per i team CMC, CQ e analitici.
Perché le impurezze peptidiche sono diverse
I limiti per le impurezze che la maggior parte dei chimici conosce derivano dall'ICH Q3A, che è stato scritto per le piccole molecole. Quelle soglie non si estendono in modo netto ai peptidi, perché le impurezze peptidiche sono grandi, strettamente correlate al principio attivo e spesso quasi identiche tra loro. I diastereomeri in particolare sono difficili da separare e di solito vengono confermati tramite spiking (aggiunta di standard) del campione con uno standard sintetizzato. Pertanto, il controllo delle impurezze peptidiche si basa su metodi specifici per la classe e su standard caratterizzati piuttosto che su un cut-off percentuale generico.
Le due famiglie di impurezze peptidiche
Le impurezze peptidiche si dividono in due gruppi: quelle generate durante la sintesi e quelle che si formano in seguito quando il peptide si degrada.
| Famiglia | Da dove provengono | Esempi comuni |
| Correlate al processo (sintesi) | Accoppiamenti incompleti e reazioni secondarie durante l'assemblaggio della catena e il clivaggio | Sequenze di delezione e troncate, sequenze di inserzione, diastereomeri da epimerizzazione, sostituzioni con residui errati, gruppi protettivi residui |
| Degradazione / correlate al prodotto | Instabilità durante la purificazione, la conservazione e la formulazione | Deammidazione di Asn e Gln, ossidazione di Met e Cys, formazione di aspartimmide e piroglutammato, idrolisi della catena, rimescolamento dei disolfuri, dimeri e aggregati |
Quali impurezze dominano dipende dalla sequenza. Un peptide con metionina o cisteina è incline all'ossidazione. Asparagina e glutammina favoriscono la deammidazione e le sequenze contenenti Asp possono formare aspartimmide. Qualsiasi peptide con ponti disolfuro, come calcitonina, vasopressina, atosiban o plecanatide, può rimescolare o ridurre i suoi legami, originando isomeri disolfuro e forme ridotte o dimeriche. Leggere la sequenza indica quali sostanze correlate aspettarsi e attorno a quali progettare i metodi analitici.
Come vengono controllate le impurezze peptidiche
Il controllo inizia nel processo e viene verificato tramite l'analisi. Dal lato del processo, l'efficienza di accoppiamento, le condizioni di clivaggio e la gestione delle soluzioni peptidiche concentrate vengono ottimizzate per mantenere basse le impurezze. Dal lato analitico, lo strumento principale è l'HPLC o UHPLC a fase inversa accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione, in cui la differenza di massa rispetto al peptide genitore identifica ciascuna impurezza. I diastereomeri e le specie co-eluenti vengono confermati tramite spiking con standard di riferimento. Gli studi di degradazione forzata, eseguiti in base alla sequenza, stabiliscono un metodo indicatore di stabilità in grado di individuare ossidazione, deammidazione, idrolisi e modifiche ai disolfuri. Vengono utilizzati metodi ortogonali quando una singola separazione non è sufficiente.
Cosa si aspettano le autorità di regolamentazione
Il controllo delle impurezze peptidiche ha ora una propria forma normativa. Si applicano quadri generali come l'ICH Q6A, e l'EMA ha pubblicato una bozza di linea guida sullo sviluppo e la produzione di peptidi sintetici che stabilisce le aspettative per il profilo e il controllo delle impurezze. Negli Stati Uniti, la guida FDA del 2021 sulle domande abbreviate per peptidi sintetici altamente purificati che fanno riferimento a originator ricombinanti è il documento chiave. Nomina peptidi tra cui glucagone, liraglutide, nesiritide, teriparatide e teduglutide, e richiede agli sviluppatori di identificare e giustificare ciascuna specifica impurezza correlata al peptide.
Gran parte di questa giustificazione riguarda l'immunogenicità. Poiché un'impurezza con un residuo aggiunto, eliminato o modificato può introdurre una nuova sequenza non presente nel principio attivo, può creare un nuovo epitopo per i linfociti T e, in linea di principio, una risposta immunitaria. Pertanto, le autorità si aspettano che gli sviluppatori caratterizzino queste impurezze e valutino tale rischio, spesso con strumenti in silico e in vitro, e mantengano le impurezze entro limiti giustificati. Questo viene fornito come contesto sul panorama normativo, non come consulenza normativa o legale.
Il ruolo degli standard di riferimento
Gli standard di riferimento sono ciò che rende misurabile il controllo delle impurezze peptidiche. È necessario uno standard ben caratterizzato del peptide genitore per confermare l'identità e calibrare i test, e standard delle impurezze specificate per lavorare direttamente con le sostanze correlate. Gli standard di impurezza consentono di localizzare un picco di sostanza correlata tramite spiking HPLC, quantificarlo rispetto a un materiale noto, convalidare il metodo ed eseguire test di idoneità del sistema. Per il lavoro regolamentato, ciascuna impurezza specificata necessita generalmente del proprio standard caratterizzato in modo che il suo livello possa essere misurato e giustificato nella registrazione.
Di quali standard di riferimento hai bisogno per il controllo delle impurezze peptidiche?
Per un peptide tipico, servono due cose: uno standard di riferimento del peptide genitore e standard delle sue impurezze designate. Lo standard genitore fissa l'identità e la calibrazione. Gli standard di impurezza, come una specifica sequenza di delezione, un diastereomero, una forma ossidata o un isomero disolfuro, consentono di assegnare e quantificare ciascuna sostanza correlata e supportare la convalida del metodo e gli studi di stabilità. Costruire questo set in anticipo, prima di un lotto pivotale, è ciò che consente a un team di soddisfare le aspettative su impurezze e immunogenicità senza dover ripetere il lavoro in seguito.
Come SynPeptide supporta il lavoro sulle impurezze peptidiche
SynPeptide (Nanjing SynPeptide Biological Technology) produce peptidi dal 2013 e fornisce peptidi come standard di riferimento e sostanze correlate utilizzati nello sviluppo analitico e nel controllo qualità. Per il lavoro sulle impurezze i punti utili sono:
- Una linea di impurezze di peptidi farmacologici e peptidi standard di riferimento, inclusi peptidi genitori e sostanze correlate per molecole come calcitonina di salmone, analoghi della vasopressina, lanreotide, atosiban, plecanatide e teriparatide.
- Sintesi su ordinazione di specifiche impurezze designate, comprese sequenze di delezione e troncate, diastereomeri, forme ossidate e isomeri disolfuro, attraverso la sintesi di peptidi su misura e la modifica dei peptidi.
- Caratterizzazione tramite HPLC e spettrometria di massa ad alta risoluzione, con un certificato di analisi e dati di identità su ogni lotto.
- Un catalogo più ampio di peptidi a catalogo e peptidi attivi che supporta il lavoro di confronto, spiking e sviluppo di metodi.
Questi peptidi sono forniti come materiali di riferimento per uso di ricerca, analitico e di produzione. Non sono farmaci finiti e non sono per uso umano, e la responsabilità normativa per un prodotto farmaceutico rimane dello sviluppatore.
Parla con il nostro team per i peptidi
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FAQ
Cosa sono le impurezze peptidiche?
Le impurezze peptidiche sono molecole indesiderate che compaiono insieme al peptide bersaglio. Si dividono in due gruppi: impurezze correlate al processo generate durante la sintesi, come sequenze di delezione, inserzione e diastereomeri, e impurezze di degradazione formate successivamente, come deammidazione, ossidazione e forme con disolfuri rimescolati. Poiché sono molto simili al peptide principale, richiedono metodi dedicati per essere separate e misurate.
Perché i peptidi necessitano di un controllo speciale delle impurezze?
I limiti per le piccole molecole nell'ICH Q3A non si trasferiscono ai peptidi, le cui impurezze sono grandi e strutturalmente simili al principio attivo e tra di loro. Il controllo si basa invece su metodi analitici specifici per i peptidi, standard di riferimento caratterizzati e, per alcune impurezze, una valutazione del rischio di immunogenicità.
Cos'è uno standard di riferimento per le impurezze peptidiche?
È un campione ben caratterizzato di una specifica impurezza, come una sequenza di delezione o una forma ossidata, utilizzato per identificare e quantificare tale impurezza in un principio attivo. Gli analisti lo aggiungono (spike) in un campione per localizzare il picco corrispondente, misurano l'impurezza rispetto ad esso e lo utilizzano nella convalida del metodo e nei test di idoneità del sistema.
Quali peptidi rientrano nella guida FDA sui peptidi sintetici?
La guida FDA del 2021 copre i peptidi sintetici altamente purificati presentati come generici di prodotti di origine ricombinante, e nomina glucagone, liraglutide, nesiritide, teriparatide e teduglutide. Per questi, ci si aspetta che gli sviluppatori identifichino ciascuna specifica impurezza correlata al peptide e la giustifichino, compreso il suo rischio di immunogenicità.SynPeptide può produrre una specifica impurezza designata?
Sì. Oltre agli standard di riferimento genitori, sintetizziamo specifiche impurezze su ordinazione, come una sequenza di delezione definita, un diastereomero, una variante ossidata o un isomero disolfuro, e le caratterizziamo tramite HPLC e spettrometria di massa con un certificato di analisi. Comunicateci la sequenza e l'impurezza e potremo valutarne la fattibilità.
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Synpeptide
Azienda CRO/CDMO specializzata in peptidi
Il team di ricerca di SynPeptide riunisce ricercatori specializzati nella sintesi, purificazione e analisi valutativa dei peptidi. Basandosi sulle competenze maturate sul campo con la sintesi conto terzi e la gamma standard di peptidi, pubblichiamo informazioni basate su evidenze rivolte a ricercatori, responsabili dello sviluppo di formulazioni e sviluppatori di prodotti. Tutti i contenuti pubblicati sono verificati sulla base delle più recenti pubblicazioni scientifiche e dei dati interni di controllo qualità. Poniamo grande attenzione all'accuratezza e alla riproducibilità, incarnando la filosofia di SynPeptide di diffondere informazioni corrette sulla scienza dei peptidi.
