化学合成为构建多肽链提供了两条成熟路线：固相多肽合成（SPPS）和液相多肽合成（LPPS）。两种方法形成相同的酰胺键，但在中间体处理、纯化方式和规模化路径上存在根本差异。选错路线可能使生产成本翻倍、周期延长数月，或产出的粗品无法纯化到目标规格。本文将从反应机理、可放大性、成本和序列适配性四个维度对比SPPS与LPPS，并说明何时混合路线才是正确答案。如需了解完整生产流程的分步说明，请参阅我们的文章多肽是如何合成的。
什么是固相多肽合成（SPPS）？
在SPPS中，C端氨基酸通过可切割的连接臂锚定在不溶性聚合物树脂上，肽链随后从C端向N端逐残基延伸。每个循环包含两个操作：脱除临时Nα保护基（Fmoc用哌啶脱除，Boc用三氟乙酸脱除），然后使用HBTU、HATU或DIC等活化试剂偶联下一个受保护的氨基酸。由于延伸中的肽链始终结合在树脂上，过量试剂和可溶性副产物可通过过滤和洗涤去除，无需分离中间体。
最后一个残基偶联完成后，多肽从树脂上切割下来，侧链保护基在同一步骤中脱除，通常使用基于TFA的切割液。粗品随后进行纯化，最常用的方法是制备型反相HPLC。
SPPS的优势：
- 速度。每个残基的偶联循环只需数分钟至一小时以内。微波辅助合成系统可进一步缩短循环时间并改善困难偶联。
- 自动化。全自动合成仪可无人值守运行，并能平行制备数十条序列，这使SPPS成为多肽文库和筛选项目的标准平台。
- 单步收率高。过量试剂推动树脂上的偶联反应趋于完全，标准残基的单步偶联收率超过99%是常态。
- 序列灵活性。非天然氨基酸、标记物以及大多数多肽修饰均可在链装配过程中直接引入。
SPPS的局限：
- 每次偶联需消耗数倍当量的氨基酸和活化试剂，洗涤溶剂用量也很大。在数公斤级规模下，这会显著推高生产成本。
- 疏水片段可能在树脂上聚集，封闭末端氨基，导致偶联或脱保护不完全。
- 缺失序列随链长累积。纯化只在最后进行一次，因此长肽粗品中可能含有大量性质相近的杂质，难以分离。
什么是液相多肽合成（LPPS）？
LPPS是多肽化学的经典方法。所有反应均在均相溶液中进行，不使用固相载体。存在两种策略：逐步延伸法与SPPS类似，逐个添加残基；汇聚式合成法则分别制备5–15个残基的受保护片段，再将其偶联拼接。每一步或每次片段偶联后，中间体都会被分离并纯化，然后合成才继续向下进行。
LPPS的优势：
- 中间体纯化。部分序列可在每个阶段进行纯化和完整表征。杂质在继续传递之前即被去除，最终偶联以经过验证纯度的原料起始。
- 试剂过量少。均相反应所需的过量程度远低于树脂上的化学，这降低了物料消耗，改善了短肽大批量生产的经济性。
- 直接监控。反应液本身可直接取样分析，因此可通过HPLC或TLC直接跟踪反应进程。
- 可放大的纯化方式。对合适的中间体，可用结晶或萃取替代色谱纯化，从而降低生产规模下的纯化成本。
LPPS的局限：
- 每一次分离都消耗时间和物料，整个过程劳动密集、周期长。
- 超过约10个残基的受保护中间体往往溶解性较差，给偶联和后处理带来困难。
- 自动化程度有限，且不存在通用方案。保护基、偶联试剂和溶剂都需针对每条序列逐一选择，因此投产前通常需要工艺开发。
SPPS与LPPS的直接对比
| 参数 | SPPS | LPPS |
|---|---|---|
| 反应介质 | 不溶性树脂（凝胶相） | 均相溶液 |
| 合成策略 | 逐步延伸，C→N | 逐步延伸或汇聚式（片段缩合） |
| 中间体纯化 | 不可行，仅在最后纯化一次 | 常规操作，每步或每个片段后纯化 |
| 自动化 | 有全自动平台 | 有限，以手工操作为主 |
| 合成速度 | 快（数小时至数天） | 慢（数天至数周） |
| 试剂过量程度 | 高（每次偶联通常2–5当量） | 适中 |
| 典型序列长度 | 常规约50–60 aa，优化方案可更长 | 短肽（<10 aa）或受保护片段 |
| 过程监控 | 间接（检测切割、Kaiser试验） | 对反应液直接进行HPLC分析 |
| 最佳经济性 | 毫克至克级；较长序列的中等公斤级 | 大批量的短肽 |
决定正确路线的五个因素
1. 序列长度
长度是第一道筛选条件。约10个残基以下，LPPS是可行选项，大批量时可能更便宜。10至60个残基之间，SPPS是默认选择，因为其循环式装配快速且可靠。超过60–80个残基后，任一平台上的纯逐步路线都有风险，通常需要汇聚式混合策略。对于通过定制多肽合成交付的长序列，在报价阶段就完成路线规划，可避免后续合成失败。
2. 序列难度与聚集
富含Val、Ile、Leu、Phe或β折叠形成基序的序列容易在链装配过程中聚集。在树脂上，聚集会封闭末端氨基，降低偶联效率。常规对策包括低载量树脂、假脯氨酸二肽、主链保护基、双重偶联和微波辅助。如果困难区域经优化后仍然失败，将该区域改为液相片段单独制备，往往比强行用SPPS合成全序列更有效。
3. 批量规模与生产成本
在毫克至克级规模，速度和灵活性占主导，SPPS几乎在所有比较中胜出。对于结构简单的短肽的数公斤级生产，LPPS通常能提供更低的每公斤成本，因为试剂过量适中，且中间体可用结晶而非色谱纯化。对于较长序列的大规模多肽合成，混合路线通常在收率、纯度和成本之间取得最佳平衡。
4. 修饰与结构复杂度
大多数修饰——乙酰化、酰胺化、磷酸化、荧光标记、生物素、PEG化——都便于在树脂上使用正交保护的结构单元引入。环化可根据环的大小和序列柔性选择在树脂上或溶液中进行；受约束序列请参阅我们的环肽能力介绍。最终的偶联步骤，例如连接药物载荷或脂质链，即使多肽本身由SPPS制备，也常常在溶液中完成。
5. 开发阶段与时间要求
发现阶段的工作需要速度和平行通量，SPPS是默认选择。早期临床物料也通常采用SPPS或混合路线生产，因为时间窗口紧张。在锁定商业化供应工艺之前，应对LPPS或片段缩合的经济性进行测算，因为注册后变更生产路线代价高昂且周期漫长。
混合路线：片段缩合
大多数高产量治疗性多肽并非由单一方法生产。在混合工艺中，受保护的片段先由SPPS制备，在保留侧链保护基的状态下从树脂上切割，逐一纯化和表征，然后在溶液中偶联。这种安排结合了SPPS的速度和LPPS的中间体控制能力。缺失序列被限制在片段长度以内，最终装配以经过验证的物料起始。
36个残基的HIV融合抑制剂恩夫韦肽（enfuvirtide）是有充分文献记载的工业案例：其片段在固相载体上制备，再在溶液中缩合。对于超过40–60个残基的多肽，汇聚式路线往往是唯一经济的选择，因为纯逐步路线的累积收率会随每个偶联循环递减。即使单步收率达到99%，30次偶联后理论收率也仅剩约74%；将同一序列拆分为三个片段，可挽回大部分损失。
项目生命周期中的路线选择
路线选择很少是一次性决定。一条分子通常在发现和筛选阶段采用SPPS，在临床前和早期临床物料阶段采用优化后的SPPS或混合工艺，并在商业化批量能够支撑工艺开发投入时，重新评估LPPS或片段缩合路线。尽早规划这一转换，可避免在最不利的阶段重新开发工艺、重新审核供应商。同时运行两种平台的多肽CDMO可以让同一条分子从毫克级走到公斤级，而无需更换底层化学团队或分析文件链。
我们的路线选择方法
SynPeptide并行运营SPPS、LPPS、微波辅助合成和片段缩合四个平台，因此路线选择由序列本身决定，而非受设备条件限制。项目在报价前即进行序列级评审：长度、疏水性、修饰模式、目标规模和纯度规格都会纳入路线决策。我们支持最长200个氨基酸的合成、最高98%的纯度和每月3公斤的产能，并提供完整的COA、HPLC和MS文件。
如果您正在为新序列评估合成路线，请将序列、目标数量和纯度要求发送给我们。我们的化学家将回复一份路线建议，并附上现实的周期和收率预估——联系我们的团队开始评审。
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Synpeptide
多肽专业CRO/CDMO企业
SynPeptide研究团队汇聚了一批专注于多肽合成、纯化与分析评估的研究人员。基于受托合成产品与常规目录多肽实验一线积累的实践经验，我们面向科研人员、制剂开发人员和产品开发者，发布有据可依的专业内容。所有发布内容均依据最新学术文献并结合公司内部质量管理数据进行了验证，重视准确性与可重复性，践行SynPeptide「恰当传播多肽科学信息」的理念。
